Kromatografi
lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan yang didasarkan pada prinsip adsorpsi.
Fasa diam pada KLT berupa pelat tipis (0,25 mm) yang terbuat dari alumunium
oksida atau silika gel dan fasa gerak berupa eluen atau campuran pelarut yang
dapat mengelusi sampel secara sempurna.
Pada prinsipnya setelah sampel ditotolkan di atas fasa diam, senyawa-senyawa dalam sampel akan terelusi dengan kecepatan yang sangat bergantung pada sifat senyawa-senyawa tersebut (kemampuan terikat pada fasa diam dan kemampuan larut dalam fasa gerak), sifat fasa diam (kekuatan elektrostatis yang menarik senyawa di atas fasa diam) dan sifat fasa gerak (kemampuan melarutkan senyawa). Secara umum, senyawa-senyawa yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat dibandingkan senyawa-senyawa polar karena senyawa polar terikat lebih kuat pada silika yang mengandung silanol (SiOH2) yang pada dasarnya memiliki afinitas yang kuat terhadap senyawa polar.
Sebelum ditotolkan pada pelat, sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, jika sebaliknya maka akan menyebabkan pelebaran pita pada pelat. Konsentrasi sampel yang baik berkisar antara 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga bergantung pada lebarnya pita.
Pada prinsipnya setelah sampel ditotolkan di atas fasa diam, senyawa-senyawa dalam sampel akan terelusi dengan kecepatan yang sangat bergantung pada sifat senyawa-senyawa tersebut (kemampuan terikat pada fasa diam dan kemampuan larut dalam fasa gerak), sifat fasa diam (kekuatan elektrostatis yang menarik senyawa di atas fasa diam) dan sifat fasa gerak (kemampuan melarutkan senyawa). Secara umum, senyawa-senyawa yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat dibandingkan senyawa-senyawa polar karena senyawa polar terikat lebih kuat pada silika yang mengandung silanol (SiOH2) yang pada dasarnya memiliki afinitas yang kuat terhadap senyawa polar.
Sebelum ditotolkan pada pelat, sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, jika sebaliknya maka akan menyebabkan pelebaran pita pada pelat. Konsentrasi sampel yang baik berkisar antara 5-10%. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga bergantung pada lebarnya pita.
Pelat yang telah siap dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan agar proses elusi berjalan lebih cepat. Setelah pelat dielusi kemudian pelat dikeringkan dan dimulai penotolan sampel menggunakan pipa kapiler. Selanjutnya pelat kembali dimasukkan ke dalam chamber untuk mengelusi sampel dan noda yang dihasilkan dideteksi menggunakan lampu UV yang kemudian akan nampak sebagai noda berpendar. Cara ini berguna untuk senyawa-senyawa yang memiliki ikatan rangkap terkonjugasi atau aromatis. Kebanyakan adsorben KLT mengandung indicator fluorescen yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV.
Analisis
kemurnian suatu senyawa dengan KLT dapat dilakukan dengan minimal tiga kali pergantian
eluen, jika selalu dihasilkan spot tunggal pada pelat maka dapat dikatakan
senyawa tersebut merupakan senyawa tunggal atau murni. KLT juga dapat
menampakkan jumlah senyawa-senyawa dalam campuran dilihat dari noda atau spot
yang muncul pada pelat maka dari itu KLT dapat digunakan untuk mengikuti atau
mengontrol proses pemisahan campuran yang dilakukan menggunakan kromatografi
kolom. KLT juga merupakan suatu cara yang umum digunakan untuk memilih eluen
yang sesuai sebelum dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi kolom.
_______________
Kristanti,
Alfinda Novi, dkk. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Surabaya: Universitas Airlangga.
Komentar