Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif  untuk memisahkan suatu campuran dengan berat beberapa gram. Pada prinsipnya kromatografi kolom merupakan suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Jika sampel berupa padatan maka sampel dilarutkan dalam pelarut atau campuran pelarut yang nantinya akan digunakan untuk elusi. Pada bagian bawah kolom biasanya digunakan plat kaca masir, selain itu dapat juga digunakan glass wool atau kapas bebas lemak yang berguna untuk melewatkan eluen secara bebas tetapi menghalangi keluarnya adsorben dari kolom. Eluen atau pelarut kemudian dialirkan secara kontinu ke dalam kolom. Dengan adanya gaya gravitasi atau adanya tekanan maka eluen akan melewati kolom dan proses pemisahan senyawa akan terjadi. Seperti pada umumnya, eluen atau pelarut yang digunakan dimulai dari yang paling nonpolar dan dinaikkan secara gradien kepolarannya hingga pemisahan dapat terjadi. Sama halnya pada kromatografi lapis tipis, pemisahan dapat terjadi karena adanya perbedaan afinitas senyawa pada adsorben dan perbedaan kelarutan senyawa pada eluen.

Ketika sampel diletakkan diujung kolom, pada saat itu juga sudah terjadi peristiwa adsorpsi oleh permukaan adsorben yang berbatasan dengan sampel. Eluen yang dialirkan secara kontinu ke dalam kolom akan menyebabkan adanya peristiwa adsorpsi dan desorpsi senyawa-senyawa pada sampel. Molekul-molekul senyawa akan dibawa ke bawah kolom dengan kecepatan yang bervariasi bergantung pada besarnya afinitas molekul tersebut pada adsorben dan juga pada besarnya kelarutan molekul dalam eluen. Cairan yang keluar dari kolom ditampung dan dilakukan analisis kromatografi lapis tipis untuk melihat hasil pemisahannya.

Adsorben yang umum digunakan selain SiO₂ dan selulosa adalah alumina, yang tersedia dalam bentuk asam, basa atau netral. Adsorben ini dianjurkan hanya dipakai untuk senyawa-senyawa organik yang stabil. Pemilihan adsorben dan bentuknya (asam, basa, netral) sangat penting untuk menghindari reaksi yang dapat terjadi di dalam kolom yang tidak diinginkan selama proses elusi berlangsung, misalnya alumina asam dapat menimbulkan reaksi dehidrasi alkohol tersier dan bentuk basanya dapat mengakibatkan reaksi hidrolisis ester atau reaksi kondensasi aldol pada aldehida. Adsorben lain yang umum dipakai adalah silika gel yang khususnya digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa organik yang kurang stabil untuk dipisahkan menggunakan alumina.

Jumlah adsorben yang digunakan bergantung pada tingkat kesulitan pemisahan dan pada jumlah sampel yang akan dipisahkan. Secara umum diperlukan 30-50 gram adsorben untuk setiap satu gram sampel yang akan dipisahkan. Semakin sulit pemisahan senyawa-senyawa yang memiliki polaritas yang hampir sama maka adsorben yang digunakan akan semakin banyak.

Eluen atau pelarut yang digunakan umumnya adalah campuran dua macam pelarut. Pada awal elusi dimulai dengan eluen yang paling nonpolar yang akan membawa senyawa-senyawa yang kurang terikat pada adsorben (yang paling nonpolar). Selama proses elusi, komposisi eluen dapat divariasi dengan jalan menambahkan secara gradien pelarut yang lebih polar. Dengan demikian senyawa-senyawa lainnya juga akan terelusi berdasarkan sifat kepolarannya.

Kecepatan elusi sebaiknya dibuat konstan. Kecepatan tersebut harus cukup lambat sehingga senyawa berada dalam kesetimbangan fasa diam dan fasa geraknya. Tetapi jika kecepatan elusi terlalu kecil, maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke dalam eluen yang akan menyebabkan pita semakin lama semakin melebar yang akibatnya pemisahan tidak berlangsung dengan baik. Kecepatan elusi yang paling besar dapat dilakukan jika yang akan dipisahkan adalah campuran senyawa yang memiliki kepolaran yang sangat berbeda.

Sebelum melakukan pemisahan kromatografi kolom, sangat dianjurkan untuk mencobanya terlebih dahulu dengan kromatografi lapis tipis. Hal ini dilakukan untuk mengetahui kompleksitas campuran yang akan dipisahkan sekaligus untuk menemukan sistem eluen yang sesuai selama proses pemisahan. Beberapa hal yang harus dipehatikan:

a. Mencari campuran dua pelarut dengan perbedaan polaritas yang cukup besar dan paling mungkin. Contoh : Petroleumeter dengan diklorometana, heksana dengan etilasetat.

b. Rf sebagian besar senyawa sebaiknya lebih rendah dari 0,4. Dari beberapa pengamatan diketahui bahwa semakin kecil harga Rf suatu senyawa maka semakin banyak jumlah eluen yang diperlukan untuk mengelusi senyawa tersebut. Senyawa-senyawa yang memiliki harga Rf 0,8 dan 0,9 akan sulit untuk dipisahkan karena keduanya akan terelusi oleh eluen hanya dalam jumlah kecil.

Tahap yang paling sulit dalam kromatografi kolom adalah pengisian kolom dengan adsorben. Pengisian tersebut harus sehomogen mungkin dan harus benar-benar terbebas dari gelembung udara. Kolom tidak boleh dibiarkan kering,sehingga eluen harus terus ditambahkan karena dengan keringnya kolom akan mengakibatkan pecahnya adsorben dalam kolom.

Berikut beberapa kelemahan dari metode ini:

1. Diperlukan jumlah pelarut atau eluen yang cukup besar

2. Diperlukan waktu elusi yang sangat lama untuk memisahkan campuran 

3. Deteksi hasil pemisahan tidak dapat langsung dilakukan (diperlukan kromatografi lapis tipis)

_______________
Kristanti, Alfinda Novi, dkk. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Surabaya: Universitas Airlangga.